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吴晨，潘继伦，包志明，俞耀庭(南开大学分子生物学研究所生物活性材料教育部重点实验室, 天津300071)Studies on porous chitosan microcarriersWU Chen, PAN Ji-lun, BAO Zhi-ming, YU Yao-ting(The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract：Using chitosan as raw materials, a suitable size (300~500µm)microcarriers were prepared by suspension method, using glutaraldehyde as crosslinker, which have an average pore size of 50~70µm, density of 1.04g/ml and porosity above 86%. The microcarriers were then modified with lactose and the reacted lactose can reached to 42.6mg/g microcarriers. Rat hepatocytes were cultured on modified chitosan porous microcarriers and retained spherical shape which was similar to those in vivo and formed aggregates on the microcarriers. In conclusion, modified porous chitosan microcarriers have a promising future in the study of the hybrid bioartificial liver support system.Key words：chitosan；microcarriers；hepatocyte摘要：利用液体石蜡作分散介质，戊二醛作交联剂，制备出粒径为300～500µm，孔径50～70µm，孔隙率86％的大孔壳聚糖微载体，并以乳糖对微载体进行了糖基化修饰，在优化条件下其接糖量可达到42.6mg/g载体。用原代大鼠肝细胞进行材料的细胞相容性研究，结果显示乳糖修饰的壳聚糖大孔微载体具有良好的细胞相容性。关键词：壳聚糖；微载体；肝细胞中图分类号：O636.1；R967.4 文献标识码：A文章编号：1001-9731（2004）增刊-2451-031 引言 人工肝支持系统（bioartificial liver support system，BAL）是近年来发展起来为肝衰竭患者提供体外肝功能支持的装置，其核心部分细胞反应器由载体材料和肝细胞两部分组成，前者为细胞提供生长、代谢场所，后者为BAL提供特异性代谢功能。人工肝支持系统内肝细胞的数量和功能是能否有效替代已衰竭肝脏功能的关键[1,2]。大孔微载体高的比表面积与高的孔隙率适合于在有限的培养体积内黏附培养大量的肝细胞。壳聚糖与细胞外基质中的糖胺聚糖的分子结构相似，壳聚糖作为材料制成微载体，其细胞亲和性好，是一种制造细胞培养用微载体的良好材料[3,4]。本文用反相悬浮法和相分离法相结合，制备了微米级大孔壳聚糖微载体，提高了材料的孔隙率和比表面积，并以肝细胞表面无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特异性配体作糖基化修饰以利于细胞在材料表面的粘附。通过在微载体上培养大鼠原代肝细胞，证明乳糖修饰的大孔壳聚糖微载体是较理想的肝组织工程支架材料。2 材料和方法2.1 材料 壳聚糖，脱乙酰度90%，分子量120万，浙江省海洋生物化学有限公司；乳糖，A.R.，天津市化学试剂六厂；Wistar大鼠，200～250g，天津市军事医学科学研究院提供；Trypan Blue，上海化学试剂采购供应站；胶原酶IV，Sigma Chemical Co.Ltd；HEPES，北京鼎国生物技术发展中心；新生牛血清，联星生物技术有限公司；庆大霉素，天津金耀氨基酸有限公司2.2 大孔壳聚糖微载体的制备 取一定量液体石蜡、四氯化碳和适量span80，混合均匀后加入到三口瓶中，然后按一定油水比例加入适量2.5%壳聚糖乙酸溶液，以适当的搅拌速度在25℃下充分搅拌至壳聚糖溶胶均匀分散成合适大小液滴后，加入一定体积8%戊二醛溶液，搅拌30min后逐渐升温至40℃，恒温反应2h，经过过滤、充分洗涤后，再经过-30℃冷冻干燥，得到壳聚糖大孔微载体。 将得到的壳聚糖大孔微载体加到浓度为30mol/dm3的乙酸钠溶液中，按照硼氢化钠对初始氨基总和的摩尔比率为3：1加入硼氢化钠，室温反应12h，用蒸馏水洗至中性。2.3 大孔壳聚糖微载体的糖基化修饰 取1g吸干的微载体，加入2mL一定浓度的NaOH溶液，混匀后，加入适量环氧氯丙烷，于一定温度下摇床上振荡反应。反应完成后装柱，用蒸馏水淋洗微载体，洗出液用含有酚酞指示剂的1.3 mol/dm3的硫代硫酸钠溶液检测，至洗出液不变红，证明剩余环氧氯丙烷已洗净。取1g抽干的微载体加入到4mL不同pH值的乳糖反应体系（糖初始浓度均为35mg/mL）中，在一定温度下反应。反应结束后取出微载体，用蒸馏水洗至中性。2.4 大孔壳聚糖微载体孔隙率的测定[5] 孔隙率的测定使用Shen F等提出的方法。通过冷干前后支架重量的变化推算出孔隙率的大小。2.5 糖基化反应程度的测定[6] 用3,5－二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定反应前后乳糖浓度的变化，根据乳糖的消耗量计算出壳聚糖支架氨基的修饰程度。2.6 原代大鼠肝细胞的分离和培养 采用Seglen两步灌流法[7~11]，从重量为200～250ｇ的Wistar大鼠获得原代肝细胞。先用预灌流液(83mg/mLNaCl，0.5mg/mL KCl，24mg/mL，HEPES，pH=7.4)灌流8min，然后用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5mmol/LCaCl2, 0.05%胶原酶)继续灌流10min。将肝叶剪下，用剪刀将消化好的肝细胞轻轻刮下，获得的肝细胞悬液400r/min离心3次，每次2min，然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血清，0.2u/mL Insulin，0.292mg/mL Glutamine)。利用苔盼蓝拒染法检测细胞存活率。将分离所得的肝细胞按1×106细胞/mL的密度接3 结果和讨论3.1 糖基化条件的优化 由图1可以看出，环氧化后的微载体在偏酸性或偏碱性的条件下均可以达到接糖量较大的目的，原因在于环氧基团在酸、碱条件下均可以开环反应，但相比而言，偏酸性条件下的接糖量较高，原因是羟基是较弱的亲核试剂，当环氧氯丙烷在酸性条件下才能开环和羟基反应。当pH=4.5时接糖量大，因此乳糖的最佳接糖条件为pH=4.5。
从图2可以看出，当反应达到12h时接糖量几乎达到最大值，继续延长反应时间，其接糖量变化不是很明显，因此我们选择乳糖的反应时间为12h。其最大接糖量为42.6mg/g微载体。
3.2 红外光谱分析 图3中的CS-1中1599cm-1处的峰为壳聚糖上氨基的特征峰，在交联壳聚糖的谱图CS-2中氨基特征峰变弱，这是因为和戊二醛反应的结果，并且在1633.3cm-1和1496.4cm-1处出现C=N伸缩振动特征峰，说明壳聚糖发生交联反应有希夫碱的形成，CS-3中这两个特征峰的消失说明已将希夫碱充分还原，CS-4中在810cm-1和880cm-1 处有环氧基团吸收峰出现，说明已经发生环氧化反应。
3.3 电镜观察 从图4看到用2.5%的壳聚糖溶液制得的大孔微载体粒径为300～500µm，孔径40～70µm，粒径分布较均匀，形态规整，经测定其孔隙率为86%。 图5是乳糖修饰后微载体上细胞培养的情况，由图可见，乳糖修饰后的微载体上肝细胞密度高，肝细胞形成聚集体，保持良好的球形，表面有很多微绒毛结构，表明肝细胞处于良好的生理状态。聚集体内部细胞紧密接触，形成类组织结构。
4 结论 用反相悬浮法结合相分离法制备了微米级大孔壳聚糖微载体，并用乳糖进行修饰，确定了反应pH和反应时间的最佳条件，其接糖量达到42.6mg/g载体。修饰微载体用于原代大鼠肝细胞培养，实验结果表明，乳糖修饰壳聚糖大孔微载体具有良好的细胞相容性。参考文献：[1] Hayes, Peter C, Lee Alistair. [J]. The Lancet, 2001, 358 (9290): 1286-1287[2] Kaneko M, Fukuda J, Ijima H, et al. [J]. Materials Science and Engineering: C, 1998, 6(4): 245-248.[3] Hirano S. [J]. Polym Mater Sci Eng,1990, 63:699.[4] Yagi K, Michibayashi N, Kurikawa N, et al. [J]. Biol, Pharm, Bull, 1997,20(12):1290-1294.[5] Shen F, Cui Y L, Yang L F, et al. [J]. Polym Int, 2000, 49: 1596-1599.[6] Ruliang Li. Biochemistry Experiments. [M]. Wuhan: Wuhan Univer- sity Press, 1998, 9-11.[7] Seglen P O. [J]. Exp Cell Res, 1972; 74: 450-454.[8] Seglen P O. [J]. Methods Cell Biol, 1976; 13: 29-83.[9] Helmut Segner. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 71-81.[10] Puviani A C, Ottolenghi C, Tassinari B. et al. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 99-109.[11] Carol J, Maslansky, Gary M Williams. [J]. In Vitro, 1982, 18(8): 683-692.基金项目：天津市自然科学基金资助项目（033608011）作者简介：吴晨（1979－），女，天津人，硕士研究生，主要研究生物工程，生物医用材料论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日 |
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